1.检测试剂的准备 
① Renilla 萤光素酶 plus 检测底物（100×) , 每次开盖前需进行短暂低速离心。

②Renilla 萤光素酶 plus 检测工作液配制：根据实际使用量，以 100:1 的比例将适量的 Renilla 萤光素酶 plus 检测缓冲液与 Renilla 萤光素酶 plus 检测底物（100×) 混匀，室温避光备用。例如，将1mL Renilla 萤光素酶 plus 检测底物加入 100mL Renilla 萤光素酶 plus 检测缓冲液并充分混匀，即可制得 101mL Renilla 萤光素酶 plus检测工作液。
注：建议现配现用，剩余的工作液当次实验结束后，直接舍弃，不要留存。 
 
2.操作方法

（1）细胞检测

 ① 从细胞培养箱中取出细胞培养板，放置 5-15min ，恢复至室温。
 ② Renilla Luciferase 反应检测

使用多道排枪向每个细胞孔中加入平衡至室温的含有底物的 Renilla 萤光素酶 plus检测工作液，加样体积与初始细胞培养液体积相同并充分混匀。例如，96孔板建议加入100μL培养液，相应加入100μL检测工作液。孵育5min后于化学发光仪或多功能酶标仪中检测 Renilla Luciferase 报告基因活性。
 

（2）细胞裂解后的样品检测

·裂解细胞

a.贴壁细胞：吸去细胞培养基，用PBS缓慢轻柔地洗涤一次，洗去残留的培养基，然后将液体全部吸弃。悬浮细胞：离心去上清后，用PBS清洗细胞一次，再次离心收集细胞沉淀。
b. 配制1×细胞裂解工作液。每次使用前以1:4 比例将萤光素酶报告基因细胞裂解液（5×）与 ddH2O充分混合（例如将1mL 萤光素酶报告基因细胞裂解液（5×）加入 4mL ddH2O充分混合），置于冰上备用。
c. 按照下表推荐加入适量的1×细胞裂解工作液，室温下静置或振动摇晃裂解15min ，吹打并吸取全部细胞裂解产物至1.5mL离心管中，12000g 离心 5-10min ，取上清用于后续检测。

注：若萤光素酶的表达水平过低，可适当减少细胞裂解液用量以提高蛋白浓度，但需保证裂解液体 积可以覆盖细胞孔板底面，否则会影响裂解效果。
 

·Renilla Luciferase 反应检测 
①小心吸取 20μL细胞裂解上清依次加入至检测管或酶标板中，再加入 100μL平衡至室温的含有底物的Renilla萤光素酶plus检测工作液。
②孵育5min后于化学发光仪或多功能酶标仪中检测Renilla Luciferase报告基因活性。
注：如果对于数据的稳定性要求不太高，可以在混匀后立即进行化学发光检测。
 
保存条件
未开封试剂盒-20℃保存，自生产之日起12个月有效。 
 

注意事项
1. 检测仪器选择：能够检测化学发光的仪器都适用本试剂盒的检测，但是针对相同的样品，不同检测器 本底信号值和测量值均可能不同；且对于同一样本检测，不同仪器的数值不可横向比较。为防止孔间干 扰，推荐使用不透明白色或黑色细胞培养板。
2. 由于发光信号会受到检测环境如培养基组分、温度等影响，所以应确保同组内不同样本检测条件一致。
3. 酶促反应对温度较为敏感，加样检测前务必将检测试剂以及细胞培养板平衡至室温。
4. 如需同时检测多个细胞培养板，请尽量确保每个细胞板加入检测溶液后孵育时间一致，再进行数据读取，以此获得最佳的检测结果。
5. Renilla 萤光素酶 plus检测底物（100×）配制在无水乙醇中。由于无水乙醇容易挥发，有时会在初次使用时发现体积明显小于包装规格的情况，此时用无水乙醇把体积补足至包装规格，混匀后即可使用。
6. 海肾萤光素酶催化的生物发光的最强波长为480 nm。